Ditiotreitolul (DTT) este un agent reducător utilizat în mod obișnuit, cunoscut și ca noul aditiv verde.Este un compus organic molecular mic cu două grupări mercaptan (-SH).Datorită proprietăților sale reducătoare și stabilității, DTT este utilizat pe scară largă în experimentele de biochimie și biologie moleculară.
Rolul principal al DTT este de a reduce legăturile disulfurice din proteine și alte biomolecule.Legătura disulfură este o parte importantă a plierii și stabilității proteinelor, dar în anumite condiții experimentale, cum ar fi analiza SDS-PAGE reductibilă, recombinarea și plierea proteinelor, este necesar să se reducă legătura disulfură la două grupări tiol pentru a dezlega structura spațială a proteina.DTT poate reacționa cu legături disulfurice pentru a le reduce la grupări mercaptan, deschizând astfel structura spațială a proteinei și făcându-l ușor de analizat și manipulat.
DTT poate fi, de asemenea, utilizat pentru a proteja activitatea și stabilitatea enzimelor.În unele reacții catalizate de enzime, activitatea enzimei poate fi redusă de oxidant.DTT poate reacționa cu oxidanții pentru a-i reduce la substanțe inofensive, protejând astfel activitatea și stabilitatea enzimei.
În comparație cu agenții reducători tradiționali, cum ar fi β-mercaptoetanolul (β-ME), DTT este considerat a fi un agent reducător mai sigur și mai stabil.Nu este doar stabil în soluție apoasă, dar își menține și proprietățile reducătoare în condiții de temperatură ridicată și acido-bazică.
Utilizarea TDT este relativ simplă.În general, DTT este dizolvat într-un tampon adecvat și apoi adăugat la sistemul experimental.Concentrația optimă de DTT trebuie determinată în funcție de experimentul specific și este, în general, utilizată în intervalul 0,1-1 mM.Concentrațiile mai mici pot reduce efectele adverse asupra creșterii celulelor și pot reduce citotoxicitatea din cauza supraexprimării proteinelor țintă.Concentrațiile mai mari pot provoca o sarcină metabolică excesivă a celulelor, afectând creșterea celulelor și eficiența expresiei.
Modul de determinare a concentrației optime poate fi evaluarea nivelului de expresie al proteinei țintă prin efectuarea de teste de inducție IPTG la diferite concentrații.Testele de cultură la scară mică pot fi efectuate utilizând o gamă de concentrații IPTG (de exemplu 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM etc.), iar efectul expresiei la diferite concentrații poate fi evaluat prin detectarea nivelului de expresie al proteinei țintă (de exemplu Western detecție pe blot sau fluorescență).Conform rezultatelor experimentale, concentrația cu cel mai bun efect de expresie a fost selectată ca concentrație optimă.
În plus, puteți consulta, de asemenea, literatura relevantă sau experiența altor laboratoare pentru a înțelege intervalul de concentrație de IPTG utilizat în mod obișnuit în condiții experimentale similare, apoi optimizați și ajustați în funcție de nevoile experimentale.
Este important de reținut că concentrația optimă poate varia în funcție de diferite sisteme de expresie, proteine țintă și condiții experimentale, așa că cel mai bine este să optimizați de la caz la caz.
În rezumat, DTT este un agent reducător utilizat în mod obișnuit, care poate fi utilizat pentru a reduce legăturile disulfură din proteine și alte biomolecule și pentru a proteja activitatea și stabilitatea enzimelor.A fost utilizat pe scară largă în experimente de biochimie și biologie moleculară.
Ora postării: 28-sept-2023