Ditiotreitolul (DTT) este un agent reducător utilizat în mod obișnuit, cunoscut și sub numele de noul aditiv verde. Este un compus organic molecular mic, cu două grupări mercaptanice (-SH). Datorită proprietăților sale reducătoare și stabilității, DTT este utilizat pe scară largă în experimentele de biochimie și biologie moleculară.
Rolul principal al DTT este de a reduce legăturile disulfidice din proteine și alte biomolecule. Legătura disulfidică este o parte importantă a plierii și stabilității proteinelor, dar în anumite condiții experimentale, cum ar fi analiza SDS-PAGE reductibilă, recombinarea și plierea proteinelor, este necesară reducerea legăturii disulfidice la două grupări tiol pentru a desluși structura spațială a proteinei. DTT poate reacționa cu legăturile disulfidice pentru a le reduce la grupări mercaptan, deschizând astfel structura spațială a proteinei și facilitând analiza și manipularea acesteia.
DTT poate fi utilizat și pentru a proteja activitatea și stabilitatea enzimelor. În unele reacții catalizate de enzime, activitatea enzimei poate fi redusă de oxidant. DTT poate reacționa cu oxidanții pentru a-i reduce la substanțe inofensive, protejând astfel activitatea și stabilitatea enzimei.
Comparativ cu agenții reducători tradiționali, cum ar fi β-mercaptoetanolul (β-ME), DTT este considerat un agent reducător mai sigur și mai stabil. Nu este stabil doar în soluție apoasă, ci își menține proprietățile reducătoare și la temperaturi ridicate și în condiții acido-bazice.
Utilizarea DTT este relativ simplă. În general, DTT este dizolvat într-o soluție tampon adecvată și apoi adăugat în sistemul experimental. Concentrația optimă de DTT trebuie determinată în funcție de experimentul specific și este utilizată în general în intervalul 0,1-1 mM. Concentrațiile mai mici pot reduce efectele adverse asupra creșterii celulare și pot reduce citotoxicitatea datorată supraexprimării proteinelor țintă. Concentrațiile mai mari pot provoca o încărcătură metabolică celulară excesivă, afectând creșterea celulară și eficiența expresiei.
Modul de a determina concentrația optimă poate fi evaluarea nivelului de expresie al proteinei țintă prin efectuarea testelor de inducție IPTG la diferite concentrații. Testele de cultură la scară mică pot fi efectuate utilizând o gamă de concentrații de IPTG (de exemplu, 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM etc.), iar efectul expresiei la diferite concentrații poate fi evaluat prin detectarea nivelului de expresie al proteinei țintă (de exemplu, Western blot sau detecție fluorescentă). Conform rezultatelor experimentale, concentrația cu cel mai bun efect de expresie a fost selectată ca fiind concentrația optimă.
În plus, puteți consulta literatura relevantă sau experiența altor laboratoare pentru a înțelege intervalul de concentrație IPTG utilizat în mod obișnuit în condiții experimentale similare, apoi pentru a optimiza și ajusta în funcție de nevoile experimentale.
Este important de menționat că concentrația optimă poate varia în funcție de diferitele sisteme de expresie, proteinele țintă și condițiile experimentale, așa că este recomandat să se optimizeze de la caz la caz.
În concluzie, DTT este un agent reducător utilizat în mod obișnuit, care poate fi utilizat pentru a reduce legăturile disulfidice din proteine și alte biomolecule și pentru a proteja activitatea și stabilitatea enzimelor. A fost utilizat pe scară largă în experimentele de biochimie și biologie moleculară.
Data publicării: 28 septembrie 2023