IPTG (izopropil-β-D-tiogalactozida) este un analog al substratului β-galactozidazei, care este foarte inductibil. Sub inducerea IPTG, inductorul poate forma un complex cu proteina represor, astfel încât conformația proteinei represoare se modifică, astfel încât aceasta nu poate fi combinată cu gena țintă, iar gena țintă este exprimată eficient. Deci, cum ar trebui determinată concentrația de IPTG în timpul experimentului? Cu cât mai mare, cu atât mai bine?
Mai întâi, să înțelegem principiul inducției IPTG: operonul (elementul) lactoză al E. coli conține trei gene structurale, Z, Y și A, care codifică β-galactozidaza, permeaza și respectiv acetiltransferaza. lacZ hidrolizează lactoza în glucoză și galactoză sau în alo-lactoză; lacY permite lactozei din mediu să treacă prin membrana celulară și să intre în celulă; lacA transferă gruparea acetil de la acetil-CoA la β-galactozidă, ceea ce implică eliminarea efectului toxic. În plus, există o secvență operatoare O, o secvență de pornire P și o genă reglatoare I. Gena I codificată este o proteină represoare care se poate lega de poziția O a secvenței operatorului, astfel încât operonul (meta) este reprimat și oprit. Există, de asemenea, un situs de legare pentru proteina activatoare a genei catabolice - situsul de legare CAP în amonte de secvența de inițiere P. Secvența P, secvența O și situsul de legare CAP constituie împreună regiunea reglatoare a operonului lac. Genele codificatoare ale celor trei enzime sunt reglate de aceeași regiune de reglare pentru a realiza exprimarea coordonată a produselor genetice.
În absența lactozei, operonul (meta) lac se află într-o stare de represie. În acest moment, represorul lac exprimat de secvența I sub controlul secvenței promotorului PI se leagă de secvența O, ceea ce împiedică ARN polimeraza să se lege de secvența P și inhibă inițierea transcripției; când este prezentă lactoza, operonul (meta) lac poate fi indus. În acest sistem de operoni (meta), adevăratul inductor nu este lactoza în sine. Lactoza intră în celulă și este catalizată de β-galactozidază pentru a fi convertită în alolactoză. Aceasta din urmă, ca moleculă inductoare, se leagă de proteina represoare și modifică conformația proteinei, ceea ce duce la disocierea proteinei represoare de secvența O și la transcripție. Izopropiltiogalactozida (IPTG) are același efect ca alolactoza. Este un inductor foarte puternic, care nu este metabolizat de bacterii și este foarte stabil, deci este utilizat pe scară largă în laboratoare.
Cum se determină concentrația optimă de IPTG? Luați ca exemplu E. coli.
Tulpina de E. coli BL21 modificată genetic, care conține pGEX recombinant pozitiv (CGRP/msCT), a fost inoculată în mediu lichid LB conținând 50 μg·mL-1 Amp și cultivată peste noapte la 37°C. Cultura de mai sus a fost inoculată în 10 sticle cu câte 50 mL de mediu lichid LB proaspăt conținând 50 μg·mL-1 Amp într-un raport de 1:100 pentru cultura de expansiune, iar când valoarea OD600 a fost de 0,6~0,8, s-a adăugat IPTG la concentrația finală. Aceasta este 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. După inducție la aceeași temperatură și în același timp, s-a prelevat 1 mL din soluția bacteriană, iar celulele bacteriene au fost colectate prin centrifugare și supuse SDS-PAGE pentru a analiza influența diferitelor concentrații de IPTG asupra expresiei proteinelor, apoi pentru a selecta concentrația de IPTG cu cea mai mare expresie proteică.
În urma experimentelor, se va constata că concentrația de IPTG nu este atât de mare pe cât posibil. Acest lucru se datorează faptului că IPTG are o anumită toxicitate pentru bacterii. Depășirea concentrației va ucide și celula; și, în general, sperăm că cu cât proteina exprimată în celulă este mai solubilă, cu atât mai bine, dar în multe cazuri, când concentrația de IPTG este prea mare, se va forma o cantitate mare de incluziuni în organism, dar cantitatea de proteină solubilă scade. Prin urmare, cea mai potrivită concentrație de IPTG nu este adesea cu cât este mai mare, cu atât mai bine, ci cu cât este mai mică.
Scopul inducției și cultivării tulpinilor modificate genetic este de a crește randamentul proteinei țintă și de a reduce costurile. Expresia genei țintă nu este afectată doar de factorii proprii tulpinii și de plasmida de expresie, ci și de alte condiții externe, cum ar fi concentrația inductorului, temperatura de inducție și timpul de inducție. Prin urmare, în general, înainte ca o proteină necunoscută să fie exprimată și purificată, este recomandat să se studieze timpul de inducție, temperatura și concentrația de IPTG pentru a selecta condițiile adecvate și a obține cele mai bune rezultate experimentale.
Data publicării: 31 decembrie 2021