Există mulți eroi necunoscuți în jurul nostru, care par obișnuiți, dar, de fapt, contribuie în tăcere la viața noastră. Proteinaza K este „eroul necunoscut” în industria diagnosticului molecular, deși, în comparație cu „cei mari și puternici” din industrie, proteinaza K este atât de discretă încât am trecut cu vederea mult timp importanța ei. Odată cu izbucnirea noii epidemii de coronavirus, cererea de proteinază K a crescut vertiginos, iar oferta în țară și în străinătate este mult în urma consumului, iar toată lumea și-a dat seama brusc că proteinaza K este atât de importantă.
La ce se utilizează proteinaza K?
Proteinaza K este o serin protează cu activitate enzimatică proteolitică și își poate menține activitatea într-o gamă largă de medii (pH (4-12,5), tampon cu conținut ridicat de sare, temperatură ridicată de 70°C etc.). În plus, activitatea proteinazei K nu este inhibată de SDS, uree, EDTA, clorhidrat de guanidină, izotiocianat de guanidină etc., iar o anumită cantitate de detergent poate, de asemenea, spori activitatea proteinazei K. Proteinaza K are aplicații în tratamente medicale (dezinfecție virală și microbiană), alimente (frăgezirea cărnii), pielărie (înmuierea părului), vinificație (clarificare alcool), prepararea aminoacizilor (pene degradate), extracția acidului nucleic, hibridizarea in situ etc. Cea mai frecvent utilizată aplicație este extracția acidului nucleic.
Proteinaza K poate enzimaliza toate tipurile de proteine din probă, inclusiv acele histone care sunt strâns legate de acizii nucleici, astfel încât acizii nucleici să poată fi eliberați din probă și în extract, facilitând următoarea etapă de extracție și purificare. În detectarea acidului nucleic viral, proteinaza K este una dintre componentele importante din soluția de prelevare a virusului. Proteinaza K poate sparge și inactiva proteina de înveliș a virusului, ceea ce este mai sigur în timpul etapei de transport și detectare; în plus, proteinaza K poate degrada și RNază, previne degradarea ARN-ului viral și facilitează detectarea acidului nucleic.
Faima peste noapte a proteinazei K
Fie că este vorba de cercetarea științifică sau de diagnosticarea in vitro (IVD), extracția acidului nucleic este cel mai elementar experiment, așa că proteinaza K a fost întotdeauna o prezență foarte importantă. Cu toate acestea, în trecut, proteinaza K era mult mai puțin cunoscută decât rolul său. O mare parte din aceasta se datora faptului că relația dintre cererea și oferta de proteinază K era foarte stabilă. Puțini oameni ar crede că aprovizionarea cu proteinază K ar fi o problemă.
Odată cu izbucnirea noii epidemii de coroană, cererea de testare a acidului nucleic a crescut vertiginos. Până la sfârșitul lunii iunie 2020, China a finalizat aproape 90 de milioane de noi teste de coroană, iar acest număr este și mai alarmant la scară globală. În experimentele de extracție a acidului nucleic, concentrația de lucru a proteinazei K este de aproximativ 50-200 μg/mL. În general, este nevoie de aproximativ 100 μg de proteinază K pentru a extrage o probă de acid nucleic. În utilizarea reală, pentru a crește eficiența extracției acidului nucleic, se utilizează adesea proteinaza K într-o cantitate crescută. Detectarea acidului nucleic pentru noul coronavirus a adus o cerere mare de proteinază K. Echilibrul inițial dintre cererea și oferta de proteinază K a fost rapid rupt, iar proteinaza K a devenit peste noapte un material important de prevenire a epidemiilor.
Dificultăți în producerea proteinazei K
Deși odată cu dezvoltarea epidemiei, valoarea importantă a proteinazei K a fost apreciată de oameni, este jenant că, din cauza scăderii excesive a acesteia, puține companii autohtone s-au implicat în producția de proteinază K. Atunci când oamenii doresc să stabilească producția de proteinază K, în timpul procesului de producție s-a descoperit că proteinaza K este o proteină extrem de specială. Extinderea capacității de producție a proteinazei K într-o perioadă scurtă de timp este extrem de dificilă.
Producția la scară largă a proteinazei K se confruntă cu următoarele dificultăți
1. Expresie scăzută
Proteinaza K poate degrada nespecific majoritatea proteinelor și poate provoca toxicitate gravă asupra celulei gazdă în care se exprimă proteinaza K. Prin urmare, nivelul de expresie al proteinazei K este în general foarte scăzut. Screening-ul sistemelor de expresie și al tulpinilor care exprimă intens proteinaza K necesită, în general, un ciclu mai lung.
2. Reziduuri de pigmenți și acizi nucleici
Fermentația la scară largă introduce o cantitate mare de pigment și reziduuri de acid nucleic gazdă. Este dificil să se îndepărteze aceste impurități printr-un proces simplu de purificare, iar purificarea complexă crește costul și reduce rata de recuperare.
3. Instabilitate
Proteinaza K nu este suficient de stabilă, se poate auto-enzimola și este dificil să o depozitezi stabil la 37°C pentru o perioadă lungă de timp fără un agent protector.
4. Ușor de precipitat
La prepararea pulberii liofilizate de proteinază K, pentru a asigura un conținut mare de solide, este necesar să se adauge un agent protector liofilizat la o concentrație mare, dar când concentrația de proteinază K atinge 20 mg/ml și mai mult, este ușor ca agregarea să formeze un precipitat, ceea ce aduce dificultăți mari la liofilizarea proteinazei K cu un conținut ridicat de solide.
5. Investiții mari
Proteinaza K are o activitate protează puternică și poate hidroliza alte proteaze în laborator. Prin urmare, proteinaza K necesită zone de producție specializate, echipamente și personal pentru cercetare, dezvoltare și producție.
Soluția de proteinază K de la XD BIOCHEM
XD BIOCHEM deține o platformă matură de exprimare și purificare a proteinelor și are o experiență bogată în exprimarea și purificarea proteinelor recombinante și optimizarea proceselor de producție. Prin formarea rapidă a unei echipe de cercetare și dezvoltare, procesul de producție la scară largă a proteinazei K a fost depășit. Producția lunară de pulbere liofilizată este de peste 30 KG. Produsul are performanțe stabile, activitate specifică enzimatică ridicată și nu conține reziduuri de citocrom și acid nucleic gazdă. Vă rugăm să contactați XD BIOCHEM pentru a obține un pachet de probă (E-mail:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
Soluțiile tehnice ale XD BIOCHEM includ
Folosind integrarea plasmidelor în copii multiple, sunt selectate tulpini cu expresie ridicată și un nivel de expresie de 8g/L, ceea ce depășește problema nivelului scăzut de expresie al proteinazei K.
Prin stabilirea unui proces de purificare în mai multe etape, reziduurile de citocrom și acid nucleic ale proteinazei K au fost îndepărtate cu succes sub valoarea standard.
Prin screening cu randament ridicat al formulărilor tampon protectoare, a fost selectat un tampon care poate stoca stabil proteinaza K la 37°C.
Tampoanele de screening depășesc problema faptului că proteinaza K este ușor de agregat și precipitat la concentrații mari și pun bazele pentru liofilizarea conținutului ridicat de solide al proteinazei K.
Proba de proteinază K XD BIOCHEM
Testul de stabilitate a proteinazei K XD BIOCHEM: nu va exista nicio modificare semnificativă a activității după 80 de zile la temperatura camerei
Testul de stabilitate a proteinazei K XD BIOCHEM: nu va exista nicio modificare semnificativă a activității după 80 de zile la temperatura camerei.
Comparație a efectului de extracție a acidului nucleic al proteinazei K XD BIOCHEM și al produselor concurente. În procesul de extracție a acidului nucleic, se utilizează XD BIOCHEM și, respectiv, proteinaza K competitivă. Eficiența de extracție a proteinazei K XD BIOCHEM este mai mare, iar valoarea Ct a genei țintă este mai mică.
Data publicării: 31 decembrie 2021